Tavallisimpia jo käytössä tai kokeiltavina
olevia virologisia sovelluksia on hepatiitti
B- ja C-virusten ja HIV:n tyypitys sekä lääkeaineresistenssien
30 Moodi 4/2017
määrittäminen. NGS:n
avulla voidaan löytää harvinaisia mutatoituneita
HIV-kantoja, jotka ovat kliinisesti merkittäviä
mutta niin vähäisiä, että Sanger-sekvensoinnilla
ne jäisivät havaitsematta. Myös
herpes simplex (HSV)- ja muiden herpesvirusten
resistenssimäärityksissä ollaan siirtymässä
fenotyyppisistä määrityksistä NGS:llä
tehtäviin genotyyppisiin määrityksiin.
Tärkeä virologinen NGS-sovellusalue
voi löytyä enkefalopatioista, joissa epäillään
virusetiologiaa, mutta joissa ei voida
tavanomaisilla menetelmillä osoittaa mitään
virusta. Naccache ym. ovat julkaisseet
tapauksen, jossa likvorista ja muista
kliinisistä näytteistä etsittiin kymmeniä patogeeneja
spesifeillä PCR-testeillä, mutta
mitään tautia selittävää tekijää ei löydetty.
Lopulta likvornäytteestä tehtiin shotgun
sekvensointi monistamalla näytettä
aluksi random heksameereilla. Saaduista
sekvenssijaksoista eli readeistä 0,0012 %
edusti astrovirusvarianttia, jota ei voitu osoittaa
suolistoinfektioita varten tarkoitetulla astrovirus
PCR-testillä. Diagnoosiksi varmistui
neuroinvasiivinen astrovirusinfektio, johon
potilas menehtyi joitakin kuukausia NGS:llä
saadun diagnoosin jälkeen (3).
Mikrobin patogeeniset kannat tai resistentit
muodot saattavat edustaa hyvin pientä
osaa näytteessä olevista mikrobeista, mutta
ne voivat siitä huolimatta olla kliinisesti merkittäviä.
Jos muuntuneen mikrobin sekvenssiä
ei tunneta, NGS on ainoa menetelmä muuntuneiden
mikrobikantojen osoittamiseen.
Epidemiologisia ja muita sovelluksia
NGS soveltuu epidemiaseurantaan, taudinaiheuttajan
tai variantin nopeaan tunnistamiseen
puhkeavissa epidemioissa, epidemioiden
ennakointiin ja tartunnan lähteen
selvittelyyn. NGS:ää on käytetty esimerkiksi
muuntuneiden influenssa A -kantojen varhaiseen
osoittamiseen (4). Jo aiemmin mainitun
Ebola-epidemian aikana viruskantojen
muuntumista seurattiin NGS:n avulla lähes
reaaliaikaisesti. Ebola-epidemian jälkeen
ryhdyttiin mm. Bill ja Melinda Gatesin säätiön
rahoituksella maailmanlaajuiseen epidemioiden
ennaltaehkäisyyn. Reservoaareiksi
tunnetuista eläinlajeista etsitään NGS:llä vaarallisia
bakteereita ja viruksia. Löydösten perusteella
ennakoidaan diagnostiikan,
rokotetuotannon
ja rokotekehityksen tarpeita
sekä mm. alueellisia eristystarpeita.
Ääriesimerkki on
bioterrorismi (pernarutto)
ja biologiset aseet, joiden
diagnostiikkaan ja karakterisointiin
NGS on omiaan.
Omia sovelluksia
Olemme käyttäneet NGS-
menetelmiä bakteeriyhteisöjen
karakterisoimiseen useissa sairauksissa.
Osoitimme, että ihon mikrobiomin
suurempi diversiteetti suojaa allergialta (5).
Toinen äskettäin julkaistu tutkimuksemme
osoitti, että eräät aknen hoidossa tehokkaat
lääkkeet muuttivat ihon mikrobiomin koostumusta
(6). Parkinsonin tautia sairastavien
ja terveiden henkilöiden välillä osoitimme
eroja suoliston ja suun mikrobiomeissa (7,
8).
Virologiassa olemme käyttäneet PacBio-
sekvensointia JC-polyoomaviruspopulaatioiden
karakterisoimiseen neurologisten potilaiden
likvornäytteissä ja munuaisensiirtopotilaiden
virtsoissa (9, 10). Onnistuimme
sekvensoimaan kokonaisia virusgenomeita
ja osoittamaan neurologisten PML-potilaiden
likvorista useita erilaisia ns. neurotrooppisia
JC-viruskantoja. Ainoastaan Pac-
Bio-menetelmällä päästään karakterisoimaan
kokonaisten viruskantojen ominaisuuksia,
kun sekvenssiä ei koota lyhyistä
fragmenteista. Kaikki omissa tutkimuksissamme
tuotettu sekvenssidata on lähetetty
julkisiin tietokantoihin.
Kaupallisia NGS-analytiikassa
käytettäviä testejä
Joitakin kaupallisia reagensseja ja tietokoneohjelmistoja
on saatavilla mikrobiologiseen
NGS-sekvensointiin ja data-analyysiin.
Ensimmäisiä kaupallisia virologisia NGS-sovelluksia
ovat hepatiitti B- ja C-virusten
genotyypitys ja lääkeaineresistenssimääritykset.
Myös HIV-genotyypitykseen ja tartunnanjäljitykseen
sekä HIV:n ja HSV:n lääkeaineresistenssimäärityksiin
on kaupallisia
reagensseja. Monissa kaupallisissa testeissä
tarjotaan PCR- ja sekvensointialukkeet
sekä analyysiohjelmisto sekvenssitiedon
tulkitsemiseen. Itse sekvensointi tapahtuu
yleisillä NGS-alustoilla. Analyysiohjelmistot
perustuvat tulosten vertailuun olemassa olevien
tietokantojen kanssa.
Hyötyjä ja haasteita
NGS on herkkä menetelmä, jolla voidaan
osoittaa pieniä määriä kohdetta hyvin
kompleksisesta näytteestä.
NGS:n avulla voidaan löytää
sellaisia uusia mikrobeja,
joita ei voida viljellä laboratoriossa.
Se on myös spesifi
menetelmä, mutta lyhyitä
nukleiinihappofragmentteja
sekvensoitaessa on väärän
tulkinnan vaara, jos läheisiltä
sukulaismikrobeilta löytyy
homologinen sekvenssi.
NGS-menetelmän etuja ovat
myös geneerisyys ja mahdollisuus
löytää sekä tunnettuja
että tuntemattomia kohteita. Käyttäjän
haasteena on tunnistaa ne vaikeat diagnos-
Sovellus Sekvensoinnin kohde Käyttöönoton vaihe
Bakteerityypitys 16S rRNA -geeni Käytössä
Bakteerien antibioottiresistenssien tunnistaminen
Kokogenomisekvensointi
Käytössä
Uusien MRSA-kantojen tyypitys Kokogenomisekvensointi
Käytössä
Invasiivisten meningokokkien tyypitys Kokogenomi-
sekvensointi
Käytössä
Gonokokkien tyypitys Kokogenomi-
sekvensointi
Tulossa käyttöön
Viljelynegatiivisten bakteerinäytteiden
jatkotutkimus
16S / Kokogenomisekvensointi
Kokeiltavana
Harvinaisten bakteerilöydösten varmistus 16S / Kokogenomisekvensointi
Kokeiltavana
Hepatiitti B –viruksen genotyypitys ja lääkeaineresistenssien
määrittäminen
Polymeraasi, HBsAg Kokeiltavana
Hepatiitti C –viruksen genotyypitys ja lääkeaineresistenssien
määrittäminen
NS5B, 5’UTR, core;
NS5A, NS5B, NS3
Kokeiltavana /
Käytössä
HIV-tyypitys ja lääkeaineresistenssien määrittäminen
Integraasi, RT Kokeiltavana
Taulukko 2. Käytössä ja kokeiltavina olevia NGS-sovelluksia mikrobiologisessa diagnostiikassa
Euroopassa.
Vähäisetkin
mikrobisekvenssit,
kuten lääkeaine-
resistentit kannat,
saattavat olla
kliinisesti
merkittäviä.