28 Moodi 4/2017
Potilasnäyte
DNA/RNA-eristys
PCR (jos tarpeen)
tai muu rikastus
Kirjaston valmistus
Sekvensointi
QC
Analysointi
Tulkinta ja raportointi
Potilasnäytteen kulku NGS-analytiikassa. QC tarkoittaa sekvensointilaitteesta
tulevaa raakadataa, joka on joukko saatua
sekvenssiä ja emäskohtaisia laatuarvoja edustavia kirjaimia ja
numeroita. Datasta poistetaan väärän pituiset ja laadultaan
huonot sekvenssit, ja vain testikohtaiset laadukkaat sekvenssit
analysoidaan edelleen.
ja sekvensoinnin vaatimia alukesekvenssejä
lisätään. Sekvensointi tapahtuu täysin automaattisesti
lasin pinnalla ilman koeputkia ja
käsityötä vaativia vaiheita. Hyvinkin niukoista
näytteistä pystytään analysoimaan lähes
kaikki mikrobit, jos vain budjetti sen sallii.
Sanger-sekvensoinnilla analysoidaan aina
suuri, joskus heterogeeninen joukko molekyylejä,
eikä sillä voida tunnistaa vähemmän
edustettuja sekvenssivariantteja, vaan
pääasiassa vallitsevaa sekvenssiä (Taulukko
1). NGS-analytiikassa taas monistetaan aluksi
yksittäisiä molekyylejä, joita kutakin sekvensoidaan
useaan kertaan. NGS:llä voidaan
analysoida yksittäisestä näytteestä tuhansia
tai miljoonia yksittäisiä molekyylejä, ja
riippuen halutusta syvyydestä saadaan tarkka
kuva näytteen sisältämistä sekvensseistä.
Toistuva saman alueen syväsekvensointi
mahdollistaa vähäistenkin varianttien löytämisen
ja toisaalta tarjoaa mahdollisuuden
sekvensoinnin laadunvarmistukseen. Sanger
sekvensoinnilla voidaan yleensä erottaa
sekvenssimuunnokset, joiden osuus sekvensoitavasta
kohteesta on vähintään 10 %,
kun taas NGS:n erottelukyky on parhaimmillaan
1 % tai parempi (Taulukko 1). Jos kohteesta
sekvensoidaan esimerkiksi miljoona
molekyyliä, mikä NGS:ssä usein tulee kyseeseen,
NGS JA MIKROBIOMI
Altistumme ympäristömme mikrobeille ensimmäisestä hengenvedostamme viimeiseen. Altistuksen
lähteitä voivat olla vesi, ilma, pöly, maaperä, ravinto, ihmiskontaktit ja eläinkontaktit.
Vain pieni osa näistä mikrobeista on patogeenisia.
Eräs NGS:n tärkeä sovellus on metagenomiikka eli mikrobiologian alalla mikrobiomin tai sen
osien (bakteriomin, viromin) monimuotoisuuden selvittäminen ja karakterisointi. Mikrobiomilla
tarkoitetaan jonkin anatomisen alueen tai ekologisen lokeron (niche), esimerkiksi suoliston,
kaikkia mikrobeja, joihin luetaan bakteerit, arkit, virukset mukaan lukien bakteriofagit sekä sienet
(joskus myös muut yksisoluiset eukaryootit). Bakteriomin tutkimiseen hyödynnetään kaikilla
bakteereilla esiintyvää ja osin homologista ribosomaalisen RNA:n 16S-geeniä, joka mahdollistaa
myös bakteerien tyypityksen. Bakteriomi voi sisältää myös patogeenisia bakteereita, jotka
aiheuttavat taudin vain silloin, kun koko bakteriomin tasapaino järkkyy. Bakteriomin yhteys mm.
suolen terveyteen, allergioihin ja lihavuuteen tunnetaan.
Viromia ja sen merkitystä tunnetaan huonommin – ei vähiten siksi, että viruksilla ei ole vastaavaa
homologista geenialuetta. Elimistössä persistoi monia patogeenisia viruksia, jotka aiheuttavat
taudin esimerkiksi immunologisen tilanteen heikentyessä. Mahdollisuutta käyttää viromin
koostumusta esimerkiksi immunologisen tilanteen mittarina elinsiirron jälkeen on tutkittu,
mutta toistaiseksi ilman läpimurtoja. On luultavaa, että terveen henkilön viromi jatkuvasti stimuloi
immuunijärjestelmää, mikä nostaa elimistön immunologista valmiutta.
Terveen ja sairaan henkilön mikrobiomit ovat erilaiset, mutta vaihtelu sairaiden henkilöiden välillä
on suurempi kuin terveiden. Leo Tolstoin romaanin kuuluisan aloituslauseen ideaa voidaan
soveltaa myös tässä: Anna Karenina -periaate mikrobiologiassa kuvaa sitä, että mikrobikoostumuksessa
dysbioottisten yksilöiden (joilla mikrobikoostumus on epätasapainossa eli epäterve)
välillä on paljon enemmän vaihtelua kuin eubioottisten yksilöiden (joilla mikrobikoostumus on
tasapainossa) välillä.
Harvinainen metagenomiikan sovellus mikrobidiagnostiikassa voisi
tulevaisuudessa löytyä C. difficile -antibioottiripulin hoitoon tehtävistä
ulosteensiirroista, joissa potilaan suoleen siirrettävän ulosteen lajikoostumus
selvitetään terveen mikrobiomin karakterisoimiseksi ja
myös patogeenien poissulkemiseksi.
saadaan syvällinen kuva eri sekvenssi-
varianttien esiintyvyydestä tutkitussa näytteessä
monistumisen ollessa tasainen. Kyse
on siis hyvin demokraattisesta lähestymistavasta.
Heti NGS-menetelmien tullessa markkinoille
oli ilmeistä, että niitä voidaan soveltaa
myös diagnostiikassa. Mahdollisuus tunnistaa
mikä tahansa agenssi ilman esitietoa
taudinaiheuttajasta avaa uusia näkymiä
haastavien näytteiden diagnostiikkaan ja
tuntemattomien tai muuntuneiden organismien
tunnistamiseen. NGS on geneerinen
lähestymistapa, joka mahdollistaa minkä tahansa
DNA- tai RNA-genomin omaavan eliön
tunnistamisen. NGS:n avulla selvitettiin
esimerkiksi Saksan vuoden 2011 ravinnoksi
käytetyistä iduista aiheutuneen E. coli -epidemian
aiheuttaja sekä Haitin vuoden 2011
maanjäristyksen jälkeisen koleraepidemian
aiheuttaja. Viimeisimmän, vuosien 2014–
2016 suuren Ebola-epidemian aikana kokeiltiin
menestyksellä pientä MinION-NGS-laitetta,
jolla selvitettiin Ebola-kantojen epidemiologiaa
kenttäolosuhteissa epidemian
edetessä.
NGS-alustoja
Vuonna 2006 Biotekniikan instituuttiin hankittu
Rochen 454-laite on nykyään Helsingin
yliopiston museossa, ja useat myöhemmätkin
laitesukupolvet ovat jo poistuneet
käytöstä. Mikrobiologiseen diagnostiikkaan
soveltuvat Illumina Inc.:n laitteistot (esim.
MiSeq, NextSeq 500) ja Thermo Fisher Scientificin
laitteet (mm. Ion Torrent), joista Illuminan
laitteet ovat tavallisemmin käytettyjä.
Sekvensointi tapahtuu pienen pienissä,
yhdestä nukleiinihappomolekyylistä monistetuissa
klustereissa lasin pinnalla. Näillä
laitteilla saadaan kymmenistä miljoonista
satoihin miljooniin sekvenssijaksoa eli
readiä analyysiä kohden, mutta saatujen