Massiiviparalleelisekvensointi (NGS) mikrobiologian
näkökulmasta – ja miten se liittyy Leo Tolstoihin
4/2017 Moodi 27
MIKROBIOLOGIA
EEVA AUVINEN
on virologian dosentti ja
laboraattori HUSLABin
Virologian ja immunologian
laboratoriossa.
PETRI AUVINEN
on virologian dosentti ja
tutkimusjohtaja Helsingin
yliopiston Biotekniikan
instituutissa.
Uudet sekvensointimenetelmät tuovat
uusia mahdollisuuksia mikrobiologisen
diagnostiikan kehittämiseen.
Bakteerien, virusten ja
muiden mikrobien samanaikainen
tunnistaminen tulee mahdolliseksi. Haasteina
on jatkuvasti uudistuva teknologia, valtavan
tietomäärän hallinta ja tulosten järkevä
hyödyntäminen. Suuri potentiaali tuo mukanaan
myös eettisiä kysymyksiä: miten suhtautua
kliinisesti merkittäviin yllätyslöydöksiin
ja toisaalta satunnaislöydöksiin, joiden merkitystä
ei (vielä) ymmärretä; miten käsitellä
mahdollisesti kertyvää humaanisekvenssitietoa.
Myös kliinisen laboratorio-osaamisen
vaatimukset laajenevat: bioinformatiikasta tulee
välttämätön ja keskeinen osa diagnostiikan
asiantuntemusta.
Mitä NGS tai massiiviparalleelisekvensointi
tarkoittaa
Sekvensoinnissa hyödynnetään kullekin
eliölle ominaista DNA- tai (joidenkin virusten)
RNA-genomia. Genomien sekvensointi
alkoi jo vuonna 1977, jolloin ensimmäinen
kokonainen bakteriofagin genomi sekvensoitiin
silloin upouudella Sangerin sekvensointitekniikalla.
Myöhemmin Sanger-sekvensoinnista
kehittyi automatisoinnin myötä
hyvin tehokas menetelmä, jolla selvitettiin
ensimmäisten bakteerien genomeja ja myös
ihmisen genomi 2000-luvun alussa. Menetelmä
perustuu joko pieniin kloonattuihin
DNA-fragmentteihin tai PCR-monistuksella
tuotettuihin fragmentteihin. Sanger-sekvensointi
oli vallitseva menetelmä aina vuoteen
2005 asti, jolloin niin sanotut next generation
sequencing (NGS) -menetelmät muuttivat tilannetta
dramaattisesti.
Uusien sekvensointimenetelmien suositeltava
yhteisnimitys on massiiviparalleelisekvensointi
tai rinnakaissekvensointi. Termi kuvaa
hyvin menetelmien yhteistä periaatetta: satoja
miljoonia tai jopa miljardi sekvensointireaktiota
voidaan tehdä yhdestä näytteestä
yhdellä kertaa. Vaihtoehtoinen termi syväsekvensointi
viittaa paitsi sekvensoinnin syvyyteen
(kattavuus, peitto, coverage), eli kuinka
moneen kertaan haluttu alue sekvensoidaan,
myös mahdollisimman kattavan sekvenssitiedon
hankkimiseen yhdestä näytteestä yhdellä
kertaa ja tehokkaasti. NGS (Next Generation
Sequencing) on käyttökelpoinen lyhenne.
Ensimmäinen kaupallinen NGS-laite
oli vuonna 2005 julkaistu Rochen 454 GS20,
jollainen hankittiin Helsingin Yliopiston Biotekniikan
instituuttiin jo vuonna 2006. Suomen
ensimmäisissä NGS-analyyseissä sekvensoitiin
bakteerien genomeita.
Menetelmien keskeiset erot
NGS-menetelmissä on joitakin keskeisiä
eroja Sanger-sekvensointiin verrattuna.
Kuvassa NGS:n kulku mikrobiologisessa
diagnostiikassa esitetään pääpiirteissään.
Kliinisissä näytteissä olevia mikrobeja
rikastetaan mahdollisesti viljelemällä
tai PCR-monistuksella ja näytteestä
eristetään nukleiinihapot. Sekvensointikirjaston
valmistuksen yhteydessä haluttuja
kohteita yleensä monistetaan edelleen
Jatkuu seuraavalla sivulla
KUVA: SHUTTERSTOCK