TEEMA: HEMATOLOGIA Mitä laboratoriossa voidaan nähdä veren sivelyvalmisteesta? Sivelyvalmisteen mikroskopoinnin lyhyt oppimäärä 20 Moodi 6/2016 TARU MERI on filosofian tohtori, dosentti, joka toimii Helsingin yliopiston Biotieteiden laitoksen Yleisen mikrobiologian osastolla yliopistonlehtorina ja VITA Laboratoriossa mykologian ja parasitologian erikoistutkijana. ELISABET TYYNI toimii laboratoriohoitajana HUSLABin parasitologian yksikössä. Malarian aiheuttajat eli Plasmodium suvun itiöeläimet ovat yleisimmät veren Giemsa-värjätystä sivelyvalmisteesta löytyvät parasiitit. Malaria tautina on vaarallinen yleisinfektio, joka vaatii hoitoa pikaisesti. Malariatutkimus on aina päivystystutkimus, jota tehdään Suomessa hyvin erilaisissa laboratorioissa. Malarian ohella veren sivelyvalmisteesta voi satunnaisesti löytyä muita verenkierrossa olevia parasiittejä tai bakteereita. Tässä katsauksessa käymme läpi malarianäytteenoton, preparaattien valmistuksen, värjäyksen ja mikroskopoinnin sekä esittelemme sivelyvalmisteesta löytyvät muut taudinaiheuttajat. Malarianäytteenotto mikroskooppidiagnostiikkaa varten Malaria on trooppinen tauti, jota levittävät Anopheles –naarashyttyset. Ihmistä infektoi viisi malarialajia: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae ja P. knowlesi1. Malariaa epäiltäessä näyte otetaan välittömästi odottamatta kuumepiikkiä. Vaikka ensimmäinen näyte olisi negatiivinen, se ei sulje pois malariaa. Näytteenotto toistetaan mielellään kuumepiikkien aikana. On muistettava, että vasta vähintään kolmen negatiivisen vastauksen jälkeen malaria voidaan pitää pois suljettuna. Näytteet tulisi ottaa ennen malarialääkitystä. Malariaplasmodit ja muut veriparasiitit voidaan havaita perifeerisen veren sively- (E -Plas-O) ja paksupisaravalmisteista (B -Plas-O). Paksupisaranäytteen idea on, että punasolut hajotetaan osmoottisesti vedellä, joten mahdolliset plasmodit eivät ole punasolujen sisällä, vaan ovat havaittavissa leukosyyttien ja trombosyyttien joukossa heikosti värjäytynyt hemoglobiini taustanaan. Koska näytettä on enemmän, on valmiste 10 - 50 kertaa herkempi malarian diagnostiikkaan. Se on kätevä seulontaan, mutta lajin määritys on vaikeaa ja näytteiden mikroskopointiin tarvitaan kokemusta. Paksupisaravalmisteen värjäys ja mikroskopointi kuuluukin lähinnä erikoislaboratorion tutkimusvalikoimaan. Sivelyvalmisteesta määritetään plasmodilaji ja parasitemiaprosentti (parasitemian aste), joka on infektoituneiden punasolujen osuus prosentteina; molemmat vaikuttavat hoitoon. Näytelasien valmistus Suositeltavin näyte on ihopistosnäyte sormenpäästä, korvanlehdestä tai kantapäästä, sillä plasmodeja on tiheämmin kapillaariveressä kuin perifeerisessä veressä. Sormea ei saisi puristella tai lypsää, koska tällöin veri laimenee kudosnesteillä ja parasiittien määrä näkökenttää kohden vähenee. Sively ja paksupisaravalmisteet voidaan tehdä EDTA-laskimoverestä – se on erikoistilanteissa hyväksyttävää, mutta ei suositeltavaa, sillä paksupisaran tulkintaa haittaavat levällään olevat trombosyytit. Värjättävät lasit EDTA verestä on tehtävä mielellään puolen tunnin sisällä näytteenotosta, sillä malariaplasmodien morfologia saattaa muuttua pitemmässä säilytyksessä. Näytteet otetaan puhtaille, naarmuttomille objektilaseille ja niitä valmistetaan useita (3- 5 molempia). Näytelasit merkitään selvästi. Sivelyvalmiste Vetolasina käytetään toista objektilasia, jolla keskellä lasia lähellä toista päätä oleva pieni veripisara levitetään lasille. Kun veri on levinnyt vetolasin leveyden verran, vedetään pisara tasaisesti pitämällä vetolasi 45° kulmassa. Jos kulma on liian matala, valmisteesta tulee liian pitkä, tai jos kulma on liian jyrkkä, valmisteesta tulee liian lyhyt. Painettaessa vetolasia liian voimakkaasti valmisteeseen Taru Meri kertoo malariasta lisää Labquality Days -kongressissa perjantaina 10.2.2017. Katso kongressiohjelma sivuilta 24-25. tulee ”aaltoja”. Jos veripisarassa on ilmakuplia, valmisteesta tulee epätasainen. Lasi ilmakuivataan heti. Valmisteessa tulee olla pyöreästi loppuva ”häntäosa”. Jos verta on liikaa, valmisteesta tulee helposti liian paksu; tällöin on vaikea mikroskopoida riittävä määrä näkökenttiä, sillä punasolujen on oltava yhdessä tasossa. Jos verta taas on liian vähän, valmisteesta tulee liian ohut; tällöin näkökenttiä ei ole riittävästi tutkittavaksi. Oikeanpaksuinen ja hyvin vedetty näyte (Kuva 1A) on helppo mikroskopoida, joten näytteen vetämistä kannattaa harjoitella. Paksupisaravalmiste Veripisara/pisarat (1 - 3 riippuen pisaran koosta) levitetään lasille pyörittävällä liikkeellä esim. toisen objektilasin kulmalla noin 1.5 x 1.5 cm kokoiseksi alueeksi. Näytettä sekoitetaan 15 - 30 sekuntia; näin estetään fibriinin muodostuminen ja näyte kiinnittyy lasille – mutta sitä ei saa sekoittaa kuivaksi. Sekoittamaton näyte hyytyy lasille ja karisee pois kuivuessaan. Jos käytetään EDTA-verta, niin pisara/pisarat vain levitetään lasille; sekoittamista ei tarvita, sillä fibriinisäikeitä ei synny. Näytelasia värjättäessä näyte helposti huuhtoutuu pois. Valmisteen paksuus on sopiva, kun normaalikokoinen teksti on luettavissa sen läpi (Kuva 1A). Näytelasin annetaan kuivua vaakasuorassa asennossa. Sivelyvalmisteiden värjäys Valmiste kiinnitetään metanolilla. Lasi värjätään tuoreella 10 % Giemsa-käyttöliuoksella 30 - 40 min. Käytettävän laimennuspuskurin pH:n tulisi olla 7.0 - 7.2, tällöin infektoituneet punasolut mahdollisine pilkutuksineen havaitaan paremmin. Värjäyksenä voidaan käyttää myös May-Grünwald-Giemsa -värjäystä; Giemsalla värjäystulos on malarian suhteen parempi. Lasit huuhdellaan nopeasti vesijohtovedellä, ja niiden annetaan kuivua pystyasennossa, minkä jälkeen ne ovat valmiina mikroskopoitaviksi. Sivelyvalmisteen mikroskopointi Valmisteet mikroskopoidaan immersioöljyobjektiivilla. Malariaa epäiltäessä näytteistä etsitään punasolujen sisällä olevia
Moodi No 6 | 2016
To see the actual publication please follow the link above