Page 46

MOODI | 2017 / No2

Biofi lmien diagnostiikka kehittyy 46 Moodi 2/2017 IRINA PITKÄNEN on diplomi-insinööri ja bioanalyytikkoopiskelija Metropolian Ammattikorkeakoulussa. Biofilmit on yleisesti tunnistettu kliinisesti merkittäväksi ongelmaksi niiden aiheuttamien vakavien tulehdusten sekä haastavan diagnostiikan takia. Biofilmien laboratoriodiagnostiikkaan ei ole saatavilla standardoituja menetelmiä. Viimeisimmät tutkimukset osoittavat, että preanalyyttisillä tekijöillä on merkittävä vaikutus tulosten luotettavuuteen. Mitä biofi lmit ovat? Biofilmit ovat mikrobien muodostamia kolmiulotteisia kasvustoja. Ne saattavat sisältää yhtä tai useampaa mikrobilajia, sekä niiden tuottamaa polysakkaridi- ja proteiinipitoista solunulkoista limaa. Tämä limamatriisi auttaa mikrobeja tarttumaan tiukasti erilaisille alustoille, sekä suojaa niitä ympäristön vaaroilta. Biofilmissä elävien mikrobien geenien ilmentymisessä tapahtuu merkittäviä muutoksia, jotka muuttavat mikrobin metaboliaa ja rakennetta. Monet mikrobilajit saattavat vaipua eräänlaiseen staasiin biofilmin sisällä, jolloin niiden metabolia hidastuu. Biofilmit kykenevät vapauttamaan planktonisia bakteereja, jotka levittäytyvät uusille kasvualustoille. (1-7) Biofi lmien kliininen merkitys Biofilmit aiheuttavat ihmisissä yleensä kroonisia tulehduksia joko haavoissa, hengitysteissä tai proteesien ja implanttien pinnoilla. Kliinisesti merkittävimpiä biofilmejä muodostavia bakteereja ovat muun muassa S. aureus, S.epidermidis ja P. aeruginosa, mutta monia muitakin biofilmejä muodostavia bakteerilajeja tunnetaan (1-8). Bakteerien lisäksi myös jotkin hiivasienet kykenevät muodostamaan biofilmejä, merkittävimpiin lajeihin kuuluu Candida albicans. Bakteerien tavoin myös hiivojen vastustuskyky erilaisia hoitomuotoja vastaan kasvaa biofilmin muodostuttua. Hiivojen hoitoon on olemassa hyvin vähän toimivia lääkeaineita, joten vastustuskykyiset hiivabiofilmit ovat merkittävä kliininen haaste. (9) Merkittävä biofilmitulehduksiin liittyvä ongelma on niiden hoitaminen. Paksu limamatriisi ja hidastunut metabolia suojelevat mikrobeja tehokkaasti sekä immuunipuolustukselta että antibiooteilta, joten biofilmin hävittäminen on lähes mahdotonta. Implanttien ja proteesien tapauksessa ainoa hoitokeino on usein implantin tai proteesin poistaminen. Tästä syystä suurin osa biofilmejä koskevista tutkimuksista käsittelee nimenomaan nivelproteeseja. Nivelproteesit ja niihin liittyvät tulehdukset yleistyvät ikääntyvässä väestössä. (1-8) Diagnostiset haasteet Biofilmien ominaisuuksista johtuen kroonisia tulehduksia on joskus hyvin vaikea diagnosoida. Staasiin vaipuneet mikrobit eivät välttämättä kasva viljelyalustoilla. Lisäksi mikrobien tuottama sitkeä matriisi vaikeuttaa luotettavaa näytteenottoa. Useita mikrobeja sisältävien biofilmien diagnostiset tulokset voivat olla epäselviä ja vaikeita tulkita. Biofilmien aiheuttama tulehdus ei välttämättä oireile näkyvästi tai tyypillisesti, joten tulehdusta ei aina osata edes epäillä. Jos taas tulehdusoireet ovat voimakkaita, potilaille saatetaan aloittaa antibioottihoito, joka vaikeuttaa diagnostiikkaa entisestään. Mitä aikaisemmin tulehdus havaitaan, sitä todennäköisemmin se saadaan hoidettua. (2-8) Biofilmit ovat lääketieteessä kohtuullisen uusi ilmiö, joten niiden diagnosointia ja hoitoa koskevat vakiintuneet ohjeet ja standardit ovat vielä kehitteillä. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) on julkaissut viimeisimpiin tutkimustuloksiin perustuvia suosituksia biofilmien diagnostiikkaan ja hoitoon liittyen (1). Menetelmien etuja ja haittoja Preanalyyttiset esikäsittelyt Biofilmimatriisia pystytään hajottamaan ultraäänellä eli sonikaatiolla, jolloin mikrobit vapautuvat matriisin sisältä. Sonikaationäytteestä tehdyt viljelyt ovat sensitiivisempiä kuin ilman käsittelyä tehdyt näytteet, mutta spesifisyys voi olla huonompi (10). Sonikaatioon tarvittava laitteisto on edullinen ja menetelmä yksinkertainen, miksi se onkin jo melko yleisessä käytössä, etenkin poistettujen implanttien ja proteesien käsittelyssä. (2, 7-8) Sonikaatio ei ole ainoa esikäsittelymenetelmä proteeseille ja implanteille. Dithiothreitol (DTT) pystyy hajottamaan biofilmejä ja vapauttamaan bakteereja viljelyyn. Yhdisteen pohjalta on kehitetty patentoitu tuote (MicroDTTect). Menetelmä mahdollistaa proteesi- tai implanttinäytteen eristämisen heti leikkaussalissa, mikä vähentää kontaminaation riskiä. Lisäksi menetelmä on edullinen ja helppokäyttöinen. Verrattuna pyyhkäisynäytteistä tehtyihin viljelyihin, MicroDTTect oli sensitiivisempi ja mahdollisti useamman eri bakteerilajin tunnistamisen. Kuitenkin muutamissa tapauksissa MicroDTTect ei havainnut bakteeria, joka löytyi pyyhkäisyviljelystä. (11) Taulukkoon 1 on koottu eri näytteenottotapoja ja niille soveltuvia esikäsittelyjä, sekä listattu niiden etuja ja haittoja. Molekyyligeneettiset menetelmät Viljelyn lisäksi molekyyligenetiikkaan perustuvat menetelmät sopivat biofilmien diagnostiikkaan. PCR-laitteistot alkavat yleistyä mikrobiologisessa diagnostiikassa, joten laitteistoa ei välttämättä tarvitse erikseen hankkia. PCR-menetelmät ovat nopeita, ja mahdollistavat kvantitatiivisen tutkimuksen (Real-TIme PCR). PCR-menetelmillä ja pyrosekvensoinnilla voidaan myös helposti tunnistaa infektion aiheuttava laji. Tutkimustiedon pohjalta pystytään kokoamaan tietokantoja, joihin tuloksia voidaan verrata, sekä suunnittelemaan uusia lajispesifisiä alukkeita. PCR-menetelmien haittapuolina ovat mahdolliset väärät positiiviset tulokset, sekä kyvyttömyys erottaa kuolleita ja eläviä bakteereita toisistaan, jos mitataan DNA:ta. RNA:ta tuotetaan vain elävissä soluissa, mutta se hajoaa herkästi. Sonikaatio soveltuu hyvin myös PCR-näytteiden käsittelyyn irrottamaan bakteereita biofilmistä. (2, 6) ESCMID suosittelee molekyyligenetiikan menetelmiä siinä tapauksessa, jos patogeeni ei kasva perinteisillä maljoilla. Sonikaatiota ja vorteksointia bakteerien irrottamiseksi biofilmistä suositellaan myös (1). Teoriassa molekyyligeneettisten menetelmien pitäisi olla herkempiä ja spesifisempiä kuin viljelymenetelmien, mutta viimeaikaisten tutkimusten tulosten perusteella väite ei aina pidä paikkaansa. Molekyyligeneettiset menetelmät ovat herkkiä kontaminaatioille, joten näytteenottotekniikoilla ja muilla preanalyyttisilla tekijöillä on suuri vaikutus tuloksiin ( 12–14). Taulukkoon 2 on listattu eri molekyyligeneettisten menetelmien etuja ja haittoja. Preanalyyttiset tekijät ovat kriittisiä Molekyyligeneettiset menetelmät ovat jo yleisessä käytössä mikrobiologian diagnostiikassa, ja ne voisivat olla herkkiä ja spesifisiä tapoja myös biofilmien tunnistamiseen, mutta ne ovat hyvin herkkiä preanalyyttisille virheille. Tällä hetkellä tutkimuskenttä on hajanaista preanalyyttisten tekijöiden stan- KLIININEN KEMIA JA BIONANALYTIIKKA


MOODI | 2017 / No2
To see the actual publication please follow the link above