Kliininen sienidiagnostiikka, perinteisten ”viimeisenä linnakkeena” pidetty mikrobiologian osa-alue, on tullut mielenkiintoisen murroksen kynnykselle, kun bakteerien lajinmäärityksen jo aiemmin mullistanutta MALDI-TOF MS:a (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry) on ryhdytty hyödyntämään hiivasienten tunnistuksessa. Automaation yleisen kehittymisen myötä myös hiivasienten herkkyysmäärityksiä voidaan toteuttaa aiempaa yksinkertaisemmin. Hiivat ovat yksisoluisia eukaryoottisia organismeja, jotka lisääntyvät tyypillisesti silmikoitumalla. huolimatta hiivat eivät ole yhtenäinen taksonominen mikro-organismien joukko, vaan kyseessä on geneettisesti erilaisten sienilajien yhteinen kasvumuoto (1). 8 Moodi 5/2016 JARI HIRVONEN toimii sairaalamikrobiologina Fimlab Laboratoriot Oy:n mikrobiologian yksikössä. Vastuualueena ovat erityisesti mikrobiologian automaatio ja molekyylimikrobiologia. KAISU RANTAKOKKO-JALAVA on kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri ja dosentti. Hän työskentelee vs. osastonylilääkärinä Tyks Mikrobiologialla ja genetiikalla. laboratoriomenetelmien Samankaltaisesta kasvutavastaan MALDI mahdollistaa eri mikrobilajien tarkan ja toistettavan tunnistuksen. Ihmiset altistuvat ympäristössä esiintyville hiivoille päivittäin, ja hiivoja myös kasvaa saprofyytteinä iholla ja limakalvoilla. Hiivat ovat kuitenkin myös opportunistisia taudinaiheuttajia, eli elinympäristössä vallitsevan tasapainon heilahtaessa niiden eduksi ne voivat aiheuttaa isännälleen eriasteisia infektioita ihon ja limakalvojen pinnallisista tulehduksista aina syvään sieni-infektioon asti. Erityisesti potilailla, joiden immuunipuolustus on voimakkaasti heikentynyt perussairauden tai sen hoidon takia, elimistön syviin kudoksiin tunkeutuviin hiivainfektioihin liittyy merkittävä, jopa yli 40 %:n kuolleisuus (1, 2). Vaikka Candida albicansin aiheuttamat kandidemiat ovat yleisimpiä, myös muut Candida-lajit, kuten C. glabrata ja C. krusei, sekä muut hiivat kuten Pichia, Cryptococcus, Saccharomyces ja Trichosporon -lajit voivat olla infektioiden taustalla (1, 2). Hiivasienten tunnistaminen Perinteisesti hiivasienten tunnistaminen kliinisistä potilasnäytteistä on vaatinut mikrobiologian laboratorioilta mykologian erityisosaamista. Hiivoja on pyritty osoittamaan näytteestä joko suoran mikroskopoinnin ja/ tai viljelyn avulla. Viljelystä potentiaalinen hiivakasvu on tunnistettu ja nimetty mm. pesäkemorfologian, mikromorfologian, seerumitestin sekä sokerien fermentaatio- ja assimilaatiotestien avulla. Fenotyyppisiin ominaisuuksiin perustuva perinteinen lajinmääritys on kuitenkin melko työlästä ja aikaa vievää, joten diagnostiikkaa avustavat uudet tekniikat ovat eittämättä tervetullut lisä mykologian toimintoihin. Automatisoidut mikrobien fenotyyppisiä ominaisuuksia mittaavat laitteistot ovat yksi potentiaalinen vaihtoehto hiivasienten tunnistuksessa. Kyseiset laitteistot ovat käytännössä inkubaattori-spektrofotometreja, jolla voidaan automatisoida hiivalajimäärityksen manuaalinen ja visuaalinen vaihe. Niistä ainakin osan on osoitettu soveltuvan melko hyvin sienitunnistuksen apuvälineeksi (3). Automaattien tunnistuskykyä rajoittaa kuitenkin testikaseteilla olevien biokemiallisten reaktiosarjojen lukumäärä ja laitevalmistajan kantakirjaston sisältö. Oma käytännön näkemys on, että mikäli päätyy hankkimaan kyseisen automaattilaitteiston yksistään laboratorion apuvälineeksi, soveltuu se parhaiten syvien sieninäytelöydösten tai hieman harvinaisempien hiivayksilöiden lajitunnistukseen. Pinnalliset hiivalöydökset kannattanee tunnistaa yksinkertaisemmilla, joskin manuaalisilla testeillä, sillä fenotyyppisiin reaktioihin perustuvat automaatit vaativat keskimäärin n. 16 tunnin inkubaatioajan, ja laitteissa on vain tietty rajallinen määrä näytepaikkoja. Fenotyyppisten testien ohelle hiivasienten lajitunnistukseen on valjastettu joitakin vuosia sitten sienten 18S rRNA ja ITS (Internal Transcribed Spacer) geenialueiden sekvensointi (1). Sekvensoinnin erottelukyky on perinteisiin menetelmiin verrattuna täysin omaa luokkaansa, ja sitä pidetäänkin tätä nykyä lajitunnistuksen kultastandardina. Sekvensointi vaatii kuitenkin asiantuntijuutta, useita erikoislaitteistoja sekä töihin soveltuvat laboratoriotilat. Tämä selittänee sen, miksi sekvensointi ei ole vielä kunnolla asettunut osaksi kliinisen mikrobiologian laboratoriotoimintaa, ja miksi sitä ei voida käyttää rutiininomaisesti hiivasienten tunnistuksessa. MALDI-TOF MS hiivojen tunnistuksessa Uusin hiivasienten tunnistamisessa hyödynnettävä työkalu on matriisiavusteinen laserdesorptioionisaatio lentoaikamassaspektrometria eli MALDI-TOF MS. Vaikka itse menetelmä ei ole yleisesti ottaen uusi, on se sitä kliinisen mikrobiologian laboratorion näkökulmasta. Moni onkin saattanut pohtia, onko MALDI-TOF MS yhtä käyttökelpoinen hiivojen kuin bakteerien tunnistuksessa, ja onko menetelmästä korvamaan muut perinteiset sienidiagnostiikan menetelmät. Lähtökohtaisesti MALDI mahdollistaa eri mikrobilajien tarkan ja toistettavan tunnistuksen, sillä jokaisella lajilla ja jopa joidenkin lajien alalajeilla on omanlaisensa proteiiniprofiili (4). Hiivojen tunnistuksessa näytteen esikäsittelyn on todettu olevan kuitenkin kriittisempi vaihe kuin bakteerien tunnistuksessa. Huono esikäsittely voi tuottaa hiivasoluista huonolaatuista proteiinispektriä ja siten johtaa virheellisen lajitunnistustulokseen tai siihen, ettei tulosta saada laisinkaan. Jotta tietyistä hiivasienistä saataisiin kunnollinen proteiini- TEEMA: MIKROBIOLOGIA Hiivojen tunnistaminen ja herkkyysmääritys – MITEN JA MILLOIN?
Moodi No 5 | 2016
To see the actual publication please follow the link above