MALDI-TOF VERIVILJELYDIAGNOSTIIKAN APUNA ANNIKA NEVALAINEN, osastonlääkäri, HUSLAB JOHANNA HAIKO, erikoistuva sairaalamikrobiologi, HUSLAB EVELIINA TARKKA, sairaalamikrobiologi, HUSLAB PENTTI KUUSELA, va. osastonylilääkäri, HUSLAB Sepsis-diagnostiikan ”kultainen standardi” on veriviljely, jossa verinäytteestä 12 Moodi 5/2016 tehdään ensin rikastusviljely veriviljelypullossa, josta sitten kasvun ilmetessä tehdään jatkoviljelyt elatusainemaljoille bakteerin tunnistusta ja antibioottiherkkyyden määritystä varten. Menetelmän ”Akilleen kantapää” on veriviljelypullossa kasvavan mikrobin tunnistamiseen kuluva aika, sillä jokainen vaihe edellyttää silmin näkyvää bakteerin kasvua elatusaineilla, mikä tarkoittaa käytännössä aina vähintään yli yön kasvatusaikaa. Positiivisen veriviljelylöydöksen nopeutetut lisäanalyysit ovatkin mikrobiologisen laboratorion ajankohtaisia suuria haasteita. Oikein suunnatun antibioottihoidon tiedetään parantavan sepsispotilaan ennustetta merkittävästi, ja tarve nopealle diagnostiikalle on selkeästi olemassa. Vaikka bakteerin antibioottiherkkyyden testaus viipyisikin, jo bakteerikasvun tunnistamisesta on apua hoitoantibiootin valinnassa, sillä eri bakteerilajien yleiset antibioottiherkkyysominaisuudet ja paikalliset resistenssitilanteet ovat hyvin tiedossa. Kohti nopeutettua MALDI-TOF -tunnistusta Mikrobiologian laboratorioissa joitakin vuosia käytössä olleen massaspektrometriaan perustuvan MALDI-TOF-sovelluksen avulla on mahdollista tunnistaa useimmat potilasnäytteissä kasvavat bakteerilöydökset nopeasti suoraan elatusainemaljalla kasvavasta bakteeripesäkkeestä ilman ylimääräisiä aikaa vieviä kasvatusvaiheita. MALDI-TOF-tunnistuksessa analysoidaan bakteerikasvusta proteiiniprofiili, jota sitten verrataan tietokantaan taltioituihin tunnettujen bakteerilajien proteiiniprofiileihin, jota kautta tutkittava bakteerilöydös saadaan identifioitua. Menetelmä, vaikka onkin nopea itse tunnistusvaiheessa, on kuitenkin edellyttänyt aikaa vievää bakteerin kasvamista pesäkkeiksi. Koska MALDI-TOF-sovellus on nopeudellaan ja vaivattomuudellaan mullistanut bakteerien ja hiivojen identifikaation, on luonnollista, että teknologiasta pyritään kehittämään uudenlaisia sovelluksia, joiden avulla diagnostiikkaa voidaan entisestään nopeuttaa. MALDI TOF-menetelmän nopeutta ei ole kuitenkaan pystytty suoraan hyödyntämään positiivisen veriviljelynäytteen bakteeritunnistuksessa, sillä testiä ei pystytä tekemään suoraan positiivisesta veriviljelypullosta sen sisältämien testiä sekoittavien mm. verestä ja elatusaineista peräisin olevien proteiinien takia. Veriviljelypullojen käsittelyyn onkin kehitelty erilaisia useita sentrifugointi- ja suodatusvaiheita, joiden soveltaminen laajaan veriviljelyn rutiinidiagnostiikkaan on kuitenkin haastavaa. Uutena ajatuksena on ollut tehdä MALDI TOF-analyysi nopeutetusti aikaa vievää bakteerien kasvatusvaihetta lyhentämällä. Menetelmän alkutahdit kajautettiin Suomessa TYKS:n kliinisen mikrobiologian laboratoriossa, jossa uteliaat laboratoriohoitajat kokeilivat, miten MALDI-TOF-identifikaatio onnistuu positiivisista veriviljelypulloista tehdyistä viljelyistä muutaman tunnin kasvatuksen jälkeen, jolloin maljoilla oli näkyvissä vasta aivan alkavaa bakteerikasvua (Kaisu Rantakokko-Jalava, suullinen tiedonanto). Vastaavanlainen menetelmä erilaisine muunnoksineen on käytössä useissa mikrobiologisissa laboratorioissa (1-4). HUSLABin kliinisen mikrobiologian bakteriologian osastolle hankittiin ensimmäinen MALDI-TOF-laite vuonna 2013 (Vitek MS, BioMérieux), jolloin myös aloitettiin nopeutetun si(short incubation) MALDI-TOF-analyysin kehittely. Toisen MALDI-TOF-laitteen hankinnan myötä si-MALDI-TOF validoitiin laajasti HUS- LABissa ja siitä kehitettiin toimintamalli, joka on vakiinnuttanut asemansa jokapäiväisen veriviljelydiagnostiikan työkaluna huhtikuusta 2014 lähtien (5). Tekninen toteutus HUSLABissa Näyte MALDI-TOF-analyysia varten otetaan potilasnäytteen verivirjelypulloista tehdyistä hajotusviljelyistä. Analyysit, joiden MALDI-TOF-tuloksen varmuustaso on 99.9 %, raportoidaan samana iltapäivänä hoitoyksikköön alustavina tuloksina. Samalla luontaisesti moniresistenteille bakteerilajeille, kuten enterokokki, Listeria- ja Pseudomonas aeruginosa löydöksille, kommentoidaan kefalosporiinien soveltumattomuutta näiden bakteerien aiheuttamien sepsisten hoitoon, sillä kefalosporiineja käytetään usein sepsispotilaalle empiirisenä antibioottihoitona. Klinikkaa osataan tässä vaiheessa myös varoittaa, mikäli kyseessä on epidemiologisesti merkittävä ja/tai poikkeuksellinen löydös (esim. meningokokki, Salmonella, Listeria). Tulokset HUSLABissa menetelmävalidoinnin yhteydessä si-MALDI-TOF-testi tehtiin kaikkiaan yli 1100:lta positiivisesta veriviljelypullosta viljellyltä elatusainemaljalta. Gramnegatiiviset bakteerit osoittautuivat tunnistuvan paremmin, ja niistä saatiin si-MALDI TOF-menetelmällä oikea tunnistustulos n. 87 %:ssa veriviljelypulloista. Ilman tulosta jäi 8 % ja virheellisen tunnistustuloksen antoi n. 5 % näytteistä. Käytännössä kuitenkin tätä useamman potilaan bakteerilöydös saatiin oikein tunnistetuksi, sillä tunnistustulos saatettiin saada edes jostakin potilaan pullosta, vaikka osa pulloista olisikin jäänyt kokonaan ilman tulosta tai antanut oudon, ilmeisen virheellisen tunnistustuloksen. Tavanomaisimmat gramnegatiiviset sauvat, kuten Escherichia coli, Klebsiella ja P. aeruginosa tunnistuvat menetelmällä hyvin, samoin kliinisesti erityisen tärkeä meningokokkibakteeri. Jopa anaerobisen Bacteroides fragilis -ryhmän tunnistaminen onnistuu yllättävän hyvin, vaikka se ei käytetyissä kasvatusolosuhteissa kasvakaan. Tämä selittynee sillä, että si-MALDI-TOF-tulos voidaan saada pullosta maljalle levitetystä bakteerimassasta, kun analyysiä sotkevat veriviljelypullon sisällön monet proteiinit ovat ehtineet imeytyä maljaan. Virheellisistä tunnistustuloksista vain muutama yksittäinen löydös on ollut sellainen, että se olisi ollut vaarassa päätyä potilasvastaukseen. Si-MALDI-TOF-menetelmällä saatua tunnistustulosta on joka tapauksessa arvioitava kriittisesti veriviljelypullosta tehdyn gramvärjäyksen tulokseen verraten, eikä ristiriidassa värjäyksen tai muista saman potilaan pulloista saatujen si-MALDI-TOF-tulosten kanssa olevaa tulosta pidä uskoa. Joissain tapauksissa si-MALDI-TOF-menetelmällä voidaan myös saada aivan poikkeuksellisia (tai ”mahdottomia”) tunnistustuloksia (esimerkkeinä Vibrio fluvialis, Obesumbacterium proteus tai Mycobacterium kansasii, jota ei käytetyllä analysointimenetelmällä edes olisi TEEMA: MIKROBIOLOGIA
Moodi No 5 | 2016
To see the actual publication please follow the link above