LC-MS ja massaspektrometrian monet käyttötarkoitukset kliinisessä kemiassa OUTI ITKONEN Kirjoittaja on sairaalakemisti, dosentti ja erikoiskemian prosessivastaava HUSLABista. Kuva 1. Kaavakuva multiple reaction monitoring (MRM) tai selected reaction monitoring (SRM) -pyyhkäisystä. Kolmoiskvadrupolilaitteella voidaan asettaa kvadrupolien (Q1, Q3) sähkökentät sellaisiksi, että vain halutun m/z-suhteen omaavat ionit saavuttavat stabiilin lentoradan ja voivat lentää kvadrupolien läpi. Keskimmäistä kvadrupolia (q2) käytetään törmäyskammiona, jossa tutkittava 1/2013 Moodi 27 NÄYTTEEN ERI komponenttien fraktiointi nestekromatografialla (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) perustuvaan detektioon on varsin tehokas työkalu kliinisen kemian laboratoriossa. Eniten käytetyt laitetyypit ovat korkeapainenestekromatografi (HPLC) ja kolmoiskvadrupoli MS. Nestekromatografiassa näytteen komponentit saadaan erottumaan toisistaan niiden kemiallisten ominaisuuksiensa perusteella. Massaspektrometri puolestaan erottaa näytteen komponentit niiden massa/varaus (m/z) -suhteen perusteella. HPLC-laitteistot ja -kolonnit on luotettavia, jo pitkään markkinoilla olleita tuotteita. Niitä saa usealta valmistajalta monenlaisiin käyttötarkoituksiin ja niiden ominaisuuksia kehitetään jatkuvasti. Myös erittäin korkean paineen nestekromatografia (UPLC, UHPLC, RRLC) soveltuu kliiniseen diagnostiikkaan. Kolmoiskvadrupolilaitteella on mahdollista tehdä herkkiä pitoisuusmittauksia hyödyntämällä valittujen tai useiden ionien monitorointia (selected ion monitoring, SRM tai multiple ion monitoring, MRM). Tällöin pyyhkäistään (”skannataan”) spesifisesti halutuista äiti-ioneista pilkkoutuvia tytärioneja (Kuva 1). Tällaisella pyyhkäisyllä mittauksen tausta on erittäin alhainen, signaali on erittäin spesifinen ja massaspektrometrin detektorin hyötyaika on korkea, minkä vuoksi mittaukset ovat hyvin herkkiä (Kuva 2). MS-laitteistojen herkkyydet ovat jatkuvasti parantuneet, joten entistä alhaisempien analyytin pitoisuuksien mittaaminen on tullut mahdolliseksi (1). NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY on nykyään mahdollista automatisoida varsin pitkälle hyödyntäen esikäsittelyautomaatteja tai pipetointiautomaatteja, joihin on mahdollista asentaa ravistelijoita, hauteita, kiintofaasiuuttoasema ja robottikäsiä. Robottikäden avulla näytelevy voidaan tarvittaessa siirtää esimerkiksi läheiseen sentrifuugiin. Massaspektrometrin käyttöastetta voi nostaa ja analyysiaikoja lyhentää 2–4-kertaisesti käyttämällä multiplexing- tai ”moniajo” näytteensyöttäjää, joka voi synkronoida jopa neljän eri LC:n kromatografian siten, että vain pieni osa, esimerkiksi 1–2 minuuttia, tutkittavan analyytin sisältämää eluaattia ohjataan MS:aan. Muuna aikana MS:aan voidaan ohjata muiden kromatografien eluaattia vastaavalla tavalla (Kuva 3). Tällaisia ”multiplexattuja” moniajoanalyysejä tehdään esimerkiksi Mayo Medical Laboratories:ssa Rochesterissa, MN, USA, jossa allekirjoittaneella on ollut mahdollisuus vierailla (Kuva 4). Pienikokoisten lääkeaineiden, steroidihormonien ja katekoliaineiden pitoisuusmittaukset potilasnäytteistä ovat tyypillisiä LC-MS/MS-applikaatioita (2). Myös vitamiineja (3) ja peptidejä (4) voidaan mitata. Ihmisperäiset näytteet on esikäsiteltävä uuttamalla ja/tai saostamalla ennen analyysiä. Näin tehdään, jotta laitteistot pysyvät puhtaampina, saavutetaan parempi herkkyys ja tulokset ovat helpommin tulkittavia. Tyypillisiä esikäsittelymenetelmiä ovat orgaaninen uutto (esimerkiksi steroidihormonimääritykset) (5), kiintofaasiuutto (esimerkiksi metanefriinien määritykset) (6) tai saostus (esimerkiksi syklosporiini A -määritys) (7). Saostus- ja uuttomenetelmien etuna on lisäksi se, että analyytti, kuten D-vitamiini tai steroidihormonit, saadaan tällöin irtoamaan sitojaproteiineistaan ja MS:lla mitattavaan muotoon. Samalla LC-MS/MS-menetelmällä voidaan mitata tutkittavaa analyyttiä eri näytemuodoista eli seerumista, plasmasta, virtsasta, likvorista tai syljestä, kunhan näytteen esikäsittely on optimoitu kyseiselle näytemuodolle. Yksi ja sama LCMS/ MS-menetelmä voidaan myös rakentaa niin, että sillä voidaan mitata yhdellä kertaa montaa yhdistettä, vaikkapa useampaa steroidihormonia, katekoliamiinimetaboliittia tai lääkeainetta (7). Tutkittaessa proteiineja tai peptidejä potilasnäytteistä LC-MS:lla esipuhdistusmenetelminä käytetään usein epäspesifistä kiintofaasiuuttoa (4) tai spesifistä kantajaan sidottua vasta-ainetta (8). Kiintofaasiuuton etuna on se, että tarvittavia tuotteita on kaupallisesti hyvin saatavilla. Vasta-aineisiin perustuva esipuhdistus edellyttää usein immunosorbentin valmistamista itse, vaikka vasta-aineita olisikin kaupallisesti saatavilla. Kaupallisten vasta-aineiden saatavuus rajoittuu kuitenkin tavallisiin yhdisteisiin, eli eksoottisempien proteiinien vasta aineiden saatavuus voi osoittautua hankalaksi tai mahdottomaksi. Vasta-aineita kuluu esipuhdistuksessa paljon, joten kaupallisia vasta-aineita hyödyntämällä työvaihe voi muodostua suhteellisen kalliiksi. MS-DETEKTIO PERUSTUU yhdisteen massaan, tarkemmin sanottuna massan ja varauksen suhteeseen (m/z). Varsinkin isokokoisten proteiinien mittausmenetelmät perustuvat 2/2016 69 analyytti hajotetaan pilkeioneiksi törmäyskaasua käyttäen. CEM, detektori.
Moodi No2 | 2016
To see the actual publication please follow the link above